01研究背景

包括桃樹在內的大部分落葉果樹的花期都在每年3月中旬至4月中旬。此時氣溫逐漸回升，但并不穩定，時常乍暖還寒。北方冷空氣突然南下，倒春寒危害時有發生，極易引起花果的晚霜凍害。冬季休眠期的桃樹可以耐-25~-23℃低溫。脫休眠后，則耐寒性下降，尤其是花器官，對低溫極其敏感。開放的桃花在-2℃下4小時，其雌蕊將出現嚴重凍害，導致減產甚至絕產，嚴重影響果樹生產和農民收益。如何減少倒春寒引起的桃花雌蕊凍害具有重要理論價值和生產實踐意義。

早已研究發現，5-氨基乙酸丙酸（5-Aminolevulinic acid, ALA）能夠提高植物耐冷性。在桃樹上，它能提高葉片忍受-6℃低溫對光合作用能力的影響，促進可溶性糖、脯氨酸以及可溶性蛋白質等滲透調節物質的積累，提高抗氧化酶活性，減少活性氧損傷，顯著減輕桃樹葉片受到的凍害。但ALA是否能夠提高桃花雌蕊耐凍性能力尚鮮見報道，其內在機理更未見報道。

02研究問題

人們對ALA是否能夠緩解花期低溫對桃花雌蕊的傷害及其分子機制尚不知曉。本研究以‘中油4號’油桃離體花枝為試材，篩選出受ALA調控的參與桃雌蕊低溫響應的關鍵基因PpWRKY18，并驗證其生理功能，還尋找到其上游轉錄因子PpC3H37，探究了ALA緩解桃花雌蕊凍害的分子機理，旨在為果園預防倒春寒、保花保果進而提高桃樹產量提供理論依據和關鍵技術。

03研究結果

（1）以‘中油4號’油桃花枝為材料，研究發現，−3 ℃低溫6小時處理后花朵尤其是雌蕊受到嚴重凍害，雌蕊呈水漬狀，褐化，無生命跡象。如果提前一周用外源ALA預處理花枝，則桃花雌蕊受凍害程度明顯更輕（Fig. 1, A-C）。ALA處理可以提高低溫脅迫下桃花雌蕊抗氧化酶活性和滲透調節物質含量，降低活性氧積累，維持細胞膜結構完整性，進而提升雌蕊低凍性（Fig. 1, C-E）。RT-qPCR結果顯示，抗氧化酶基因（PpFeSOD3、PpPOD10/16/25/31/41、PpCAT和PpCAT-L），脯氨酸合成基因（PpP5CS1）與植物冷調節基因（PpCOR1）的表達均響應低溫刺激，而ALA進一步促進這些基因上調表達（Fig. 1, F）。

Fig. 1 Exogenous ALA improves freezing hardiness of nectarine flowers

（2）通過RNA-seq分析和RT-qPCR檢測，我們篩選到一個響應低溫和ALA處理的關鍵轉錄因子PpWRKY18（Fig. 2）。組織特異性表達分析顯示，PpWRKY18在桃花雌蕊和雄蕊中表達水平最高（Fig. 2, C）。GUS與RT-qPCR檢測顯示，PpWRKY18啟動子活性受到低溫和ALA刺激，GUS基因表達水平顯著增加（Fig. 2, B, D）。

（3）在煙草中異源過表達（OE）-PpWRKY18能夠顯著緩解低溫對植株的傷害，ALA處理可以顯著提升低溫下煙草相關同源基因表達水平，提高植株抗氧化酶活性與滲透調節物質含量，減少活性氧和丙二醛的積累，增強轉基因煙草的抗凍能力（Fig. 3），說明這是一個受ALA調控的能提高植物抗凍性的重要轉錄因子。

Fig. 3 Overexpression of PpWRKY18 enhances freezing hardiness of the transgenic tobacco plants

（4）研究發現，冷響應CBF通路的核心基因PpCBF1受到低溫與ALA的誘導（Fig. 4, A）。Y2H、BiFC、LCI和Pulldown等試驗證實，PpWRKY18和PpCBF1在蛋白質水平上存在互作（Fig. 4, B-E）。Y1H試驗表明，PpCBF1作為轉錄因子靶向結合PpP5CS1和PpCOR1啟動子，調控兩個抗凍功能基因表達（Fig. 4, F）。

Fig. 4 Identification of the interaction between PpWRKY18 and PpCBF1

（5）通過Y1H、EMSA和DLR試驗，我們發現，PpWRKY18能特異性結合到PpPOD41啟動子上的W-box，正向激活該基因表達（Fig. 5）。這為ALA誘導桃花雌蕊氧化平衡提供了分子依據。

Fig. 5 PpWRKY18 binds to the promoter of PpPOD41 to transcriptionally activate the gene expression

（6）在PpWRKY18 調控的上游，我們以proPpWRKY18為誘餌，通過酵母核文庫篩選，發現一個鋅指蛋白轉錄因子PpC3H37（Fig. 6）。RT-qPCR與GUS結果顯示，proPpC3H37受低溫和ALA正調控（Fig. 6, A, B）。Y1H、EMSA和DLR證明，PpC3H37可以結合proPpWRKY18并正向調節其表達（Fig. 6, D-H）。

Fig. 6 PpC3H37 as a transcription factor, binds to the promoter of PpWRKY18 and activates its expression

04.意義和創新

花朵是果樹產量基礎，花凍則產量受損。本研究將ALA運用于防止桃樹倒春寒危害，并且證明，提前一周基部處理，ALA可以通過木質部運輸到雌蕊，緩解-3℃低溫6小時脅迫傷害，揭示出響應低溫和ALA的關鍵轉錄因子PpC3H37和PpWRKY18，提出以PpC3H37-PpWRKY18模塊為核心的介導ALA增強桃雌蕊抗凍性的轉錄調控網絡，為闡明ALA提高植物抗凍性機理提供了科學依據，為ALA在果樹早春防寒、盛花后疏花以及保果提質中的應用提供了理論依據。

論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468014124002474